用于哺育基妨碍率评估的大肠杆菌尺度物资研制（一）

为知足快捷高效评估微生物哺育基妨碍率的用于需要，提出一种新的哺育微生物尺度物资研制思绪，并研制出具备2种特色量值的基妨菌尺大肠杆菌尺度物资。研制历程中同时运用平板计数琼脂（plate count agar,碍率PCA）哺育基以及结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar,VRBA）哺育基妨碍平均性评估、晃动性评估、评估6家试验室相助定值以及不断定度评定。大度物试验服从表明：大肠杆菌尺度物资的肠杆平均性以及晃动性精采，可能在–20℃下晃动保存6个月。资研制该尺度物资基于PCA哺育基的用于尺度值为(7.1±1.1)×103 CFU/g，基于VRBA哺育基的哺育尺度值为(6.1±1.0)×103 CFU/g。运用该尺度物资对于多个PCA哺育基以及VRBA哺育基的基妨菌尺妨碍率妨碍评估，评估服从以及国标措施有很好的碍率相关性。综上所述，评估研制的大度物大肠杆菌尺度物资可能用于多种哺育基的妨碍率评估，具备益便快捷的肠杆短处。

0 引言

食物微生物魔难是构建我国食物清静以及生物安部份系的紧张反对于以及保障。而菌落总数以及大肠菌群目的是食物微生物魔难中最根基、最罕有的检测名目。国家尺度纪律菌落总数以及大肠菌群的检测分说需要平板计数琼脂（plate count agar,PCA）哺育基以及结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar,VRBA）哺育基，因此这两种哺育基的品质直接影响菌落总数以及大肠菌群检测服从的精确性。PCA哺育基以及VRBA哺育基的品质操作也受到了微生物钻研机构、检测机构、破费厂家的高度看重。

妨碍率是哺育基品质操作的关键子的之一。现行的妨碍率评估措施来自国标GB 4789.28—2013《食物清静国家尺度食物微生物学魔难哺育基以及试剂的品质要求》。该尺度纪律，PCA哺育基以及VRBA哺育基的妨碍率评估都需要运用大肠杆菌作为质控菌株。质控菌株经由昏迷以及哺育后，分说接种到待测哺育基以及参比哺育基妨碍哺育计数，且每一个平板的接种水平需要操作在20～200 CFU之间。该措施省事难题，一再性以及再现性有待后退。针对于现行评估措施的缺陷，本名目组在以前的钻研中提出一种基于微生物尺度物资的妨碍率评估措施，即用于接种的质控菌株以尺度物资的方式存在。该措施可能清晰削减使命量、实用后退接种数目的精确性，并将光阴延迟至1天之内。鉴于此，为了快捷高效评估PCA哺育基以及VRBA哺育基的妨碍率，需要研制量值精确、平均晃动的大肠杆菌尺度物资。

微生物计数服从具备较高的哺育基依赖性。以大肠杆菌为例，统一大肠杆菌样本在差距种类哺育基上可能患上到差距清晰的计数服从。当初我国仅有的3个有证大肠杆菌尺度物资GBW(E)09109四、GBW(E)09109五、GBW(E)091096都是基于单种哺育基遏制定值以及运用的。这3个尺度物资难以知足PCA哺育基以及VRBA哺育基妨碍率评估的需要。

综上所述，本文选用大肠杆菌尺度菌株作为评估菌株，将其制备成尺度物资。同时运用PCA哺育基以及VRBA哺育基妨碍多家试验室相助定值，并对于其平均性、晃动性以及不断定度妨碍评估或者评定。研制的大肠杆菌尺度物资将具备两种特色量值，可能用于PCA哺育基以及VRBA哺育基妨碍率的评估。

1 质料与措施

1.1 试验质料

1.1.1 菌株

大肠杆菌：菌株号ATCC 25922，中国工业微生物菌种珍藏中间。

1.1.2 主要哺育基

PCA哺育基：品牌分说为北京陆桥、广东环凯、青岛海博、美国BD、英国Oxoid，随机编号为A一、A二、A三、A四、A5。

VRBA哺育基：品牌分说为北京陆桥、广东环凯、青岛海博、美国BD、英国Oxoid，随机编号为B一、B二、B三、B四、B5。

1.1.3 仪器

冻干机：Genesis SQ e L-85型，美国SP Scientific公司；电子天平：BS224S型，德国赛多利斯公司；离神思：1-14型，德国赛多利斯公司；恒温振荡哺育箱：HZQ-X100型，江苏太仓市试验配置装备部署厂；恒温哺育箱：DNP-9272型，上海精宏试验配置装备部署有限公司；去离子水机：Mill Q型，德国默克公司；低压灭菌锅：HG-50型，日本Hirayama公司。

1.1.4 试剂

磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution,PBS,p H 7.2±0.2）、营养肉汤哺育基、胰卵白胨大豆琼脂（tryptose soya agar,TSA）哺育基：北京陆桥技术有限责任公司；脱脂奶粉：美国BD公司；海藻糖、蔗糖、谷氨酸钠、麦芽糊、抗坏血酸钠：合成纯，Sigma公司；西林瓶：规格为8 m L，深圳市宝安区沙井博海玻璃废品厂。

1.2 大肠杆菌尺度物资的制备与测定措施

凭证本试验室先前的制备工艺制备大肠杆菌尺度物资。将大肠杆菌尺度菌株接种于营养肉汤哺育基，37℃、200 r/min哺育12 h。随后10 000g离心5 min，弃去上清液，菌泥用PBS重悬并稀释，患上到适宜浓度的大肠杆菌菌液。参考先前的配方配制呵护剂，退出大肠杆菌菌液后，将呵护剂分装至棕色西林瓶中。分装竣事，将西林瓶转移至冻干机内妨碍冻干。冻干停止将样品压盖密封，患上到大肠杆菌尺度物资200个单元，规格为0.5 g/瓶。

运用PCA哺育基或者VRBA哺育基测定尺度物资的措施参考GB 4789.2—2016《食物清静国家尺度食物微生物学魔难菌落总数测定》或者GB4789.3—2016《食物清静国家尺度食物微生物学魔难大肠菌群计数》第二法。运用天平称量4.5 g无菌蒸馏水复溶尺度物资，而后用PBS对于样品匀液妨碍10倍系列稀释。抉择3个适宜稀释度，每一个稀释度分说罗致1 m L样品悬液接种于无菌平皿，每一个稀释度至少一再3次。接下来运用PCA倾注平板法或者VRBA倾注平板法妨碍大肠杆菌数目的测定。

1.3尺度物资平均性评估

凭证JJF 1343—2012《尺度物资定值的通用原则及统计学道理》的要求，凭证随机抽样原则对于尺度物资的平均性妨碍评估。随机抽取11个单元的尺度物资，分说运用PCA倾注平板法以及VRBA倾注平板法对于每一个单元尺度物资的大肠杆菌数目妨碍测定，每一瓶样品一再检测3次。

1.4 尺度物资晃动性评估

晃动性审核主要波及尺度物资在运输历程中的晃动性、客户真个贮存条件以及运用实用期。首先，对于尺度物资的短期晃动性妨碍评估。魔难温度分说为–20℃以及4℃，审核光阴为7 d（分说为第0,1,3,5,7 d）。每一次从–20℃以及4℃下分说抽取3个单元的尺度物资，运用PCA哺育基以及VRBA哺育基妨碍大肠杆菌数目测定。接下来，凭证先密后疏的原则，对于尺度物资的临时晃动性妨碍评估。临时晃动性魔难温度为–20℃，审核光阴为6个月（分说为第0,1,2,4,6个月）。每一次从–20℃抽取3个单元，运用PCA哺育基以及VRBA哺育基妨碍测定。

1.5 尺度物资的定值

凭证JJF 1343—2012以及CNAS-GL29—2010的要求，尺度物资经由6家经由CNAS招供的试验室相助定值。每一家试验室分说运用PCA哺育基以及VRBA哺育基测定3个单元的尺度物资，每一个尺度物资一再丈量3次，丈量措施参考1.2节。大肠杆菌尺度物资的尺度值为6家试验室丈量服从的平均值。

1.6 评估PCA哺育基以及VRBA哺育基的妨碍率的措施

运用PCA（或者VRBA）哺育基，对于一个单元的大肠杆菌尺度物资妨碍3次一再丈量，并凭证下式合计大肠杆菌在该哺育基上的妨碍率：

式中：PR——待测PCA（或者VRBA）哺育基的妨碍率；

NS-3次运用PCA（或者VRBA）哺育基测定尺度物资的平均服从；

N0——大肠杆菌尺度物资基于PCA（或者VRBA)哺育基的尺度值。

大肠杆菌尺度物资基于PCA哺育基的尺度值为(7.1±1.1)×103 CFU/g，基于VRBA哺育基的尺度值为(6.1±1.0)×103 CFU/g（见2.4定值服从的不断定度评定）。因此运用PCA哺育基测定大肠杆菌尺度物资的服从NS应大于6.0×103 CFU/g，运用VRBA哺育基的测定服从NS应大于5.1×103 CFU/g。即待测PCA哺育基的妨碍率应知足PR≥0.84的要求；待测VRBA哺育基的妨碍率应知足PR≥0.83的要求。

1.7 差距品牌哺育基妨碍率的评估

凭证GB 4789.28—2013[9]的纪律，PCA哺育基以及VRBA哺育基的参比哺育基均为TSA哺育基。运用差距品牌的PCA哺育基（A1～A5）以及VRBA哺育基（B1～B5）、以及参比哺育基TSA，分说对于3个单元的大肠杆菌尺度物资妨碍测定。凭证式（1）合计待测PCA哺育基以及VRBA哺育基的妨碍率。同时参考国标措施，合计哺育基的妨碍率，待测哺育基的妨碍率为该哺育基的测定服从与TSA的测定服从的比值。

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